引言
多糖作為生物大分子表現(xiàn)出多種獨(dú)特的物理化學(xué)、生理和藥物特性（Jiang等人，2013；Li等人，2014；MíˇcKoVá，ˇcopíKoVá，& SyNytSyA，2007）。大多數(shù)多糖是從植物、動(dòng)物和微生物中獲得的（Qu，Liu，& Zhang，2014；Vu，Chen，Crawford，& Ivanova，2009；Zia，Anjum，Zuber，Mujahid，& Jamil，2014）。然而，制備方法通常涉及大量的前期工作，如材料選擇、提取、分離、純化以獲得目標(biāo)產(chǎn)品，而多糖的產(chǎn)率較低。因此，一種簡單、快速和高效的多糖合成方法是可取的。
先前的研究表明，在熱和酸的存在下，糖可以聚合（Allingham，1982；Li，Le，& Shi，2006a；Manley - Harris & Richards，1993）。在糖的聚合中，酸催化單糖的羥基（C - 1）質(zhì)子化作為糖基供體，非質(zhì)子化的糖作為糖基受體。在微波輻射條件下，糖分子之間的糖苷鍵迅速有效地構(gòu)建，為聚合提供能量。早期的一項(xiàng)研究成功地使用d - 葡萄糖作為反應(yīng)物，酸作為催化劑，在微波輻射條件下合成了低聚糖（Li，Le，Cheng，Wang，& Shi，2006b）和聚葡萄糖（Wang，Shi，& Le，2014）。由于其良好的加工性能和潛在的健康益處，聚葡萄糖被廣泛用作各種食品中的低能量填充劑，并部分替代脂肪和淀粉（Cerna等人，2003）。以前的研究表明，酸催化和微波介導(dǎo)的方法可能用于合成其他增值碳水化合物聚合物。由于d - 葡萄糖和d - 甘露糖的結(jié)構(gòu)相似，d - 葡萄糖的聚合反應(yīng)可能適用于d - 甘露糖。此外，含有d - 甘露糖的多糖具有許多特殊的生物功能。補(bǔ)充蘆薈聚甘露糖的飲食已被證明對被診斷患有阿爾茨海默病的成年人有積極影響（Lewis等人，2013），而來自酵母細(xì)胞壁的甘露聚糖具有抗氧化和抗突變活性（Kriˇzková等人，2006）。
據(jù)我們所知，很少有研究調(diào)查通過酸催化下的微波輻射快速有效地合成聚甘露糖。為了探索新的多糖合成方法，本工作的目的是制備和表征聚甘露糖的結(jié)構(gòu)。

材料和方法
2.1. 材料
使用去離子水和超純水。除非另有說明，所有化學(xué)品均購自Sigma - Aldrich（圣路易斯，密蘇里州，美國）。d - 甘露糖（AR級）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海，中國）。所有其他化學(xué)品均為分析純。
2.2. 聚甘露糖的制備
根據(jù)先前描述的方法（Wang等人，2014），通過微波輻射下的酸催化合成聚甘露糖。簡而言之，將50 g d - 甘露糖加入到一個(gè)開放的玻璃容器中，然后加入6 mL質(zhì)子濃度為2.5 mol/L的磷酸，并在玻璃容器中充分混合。然后將混合物放入XH - 200A微波反應(yīng)器（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司，北京，中國）的腔體內(nèi)，在115℃下進(jìn)行微波輻射（900 W）5 min，并不斷攪拌。反應(yīng)完成后，用干燥空氣冷卻混合物并粉碎，得到粗產(chǎn)物（合成途徑如圖1所示）。
2.3. 聚甘露糖產(chǎn)率的測定
通過峰面積積分法估算聚甘露糖的產(chǎn)率。使用Sugarpack - 1柱通過HPLC對合成產(chǎn)物進(jìn)行分析，條件如下：水作為流動(dòng)相，流速為0.4 mL/min，柱溫保持在85℃，進(jìn)樣量為10μL。樣品用示差折光檢測器（Waters 2410）檢測。
2.4. 聚甘露糖的純化
將粗產(chǎn)物溶解在去離子水中，然后用五倍體積的乙醇沉淀，得到d - 甘露糖和無酸產(chǎn)物。將沉淀物重新溶解在去離子水中，在0.1 MPa的真空下于60℃進(jìn)一步濃縮，然后凍干得到白色粉末。乙醇沉淀的聚甘露糖在室溫下通過Sephadex G - 25凝膠柱的凝膠滲透色譜進(jìn)一步純化。收集洗脫液并凍干，作為純化的聚甘露糖用于進(jìn)一步分析。
2.5. 分子量測定
通過配備2410差分折射率（RI）檢測器和Empower工作站（Waters，美國）的Waters 600 HPLC儀器，通過高效尺寸排阻色譜（HPSEC）測定聚甘露糖的分子量。分析柱為UltrahydrogelTM Linear 300 mm×7.8 mm id×2。洗脫液為含有NaN3（0.5 g/L）的NaNO2（0.1 mol/L）溶液，流速為0.9 mL/min。樣品先前通過膜（0.22μm，Millipore）過濾，以1 mg/mL的濃度進(jìn)樣。柱溫保持在45℃。
2.6. 單糖組成分析
通過處理樣品（30 mg）在4 mL的2 M三氟乙酸（TFA）中于115℃下4.5 h，確定聚甘露糖的單糖組成。根據(jù)先前的方法（Wang，Liu，Zhou，& Hu，2012），使用ICS5000高性能陰離子交換色譜（HPAEC）（Dionex，美國）進(jìn)行分析。
2.7. 傅里葉變換紅外（FT - IR）光譜
在Nicolet 560光譜儀（Nicolet Co.，美國）上記錄純化的聚甘露糖和d - 甘露糖的傅里葉變換紅外（FT - IR）光譜。將兩個(gè)樣品與相同劑量的固體溴化鉀（KBr）粉末混合，并將混合物制成顆粒。在4000 cm−1至400 cm−1的透射模式下對KBr顆粒進(jìn)行FTIR分光光度法測量和記錄。
2.8. 甲基化分析
根據(jù)Hakomori（1964）的方法進(jìn)行聚甘露糖的甲基化分析。將干燥樣品（20 mg）在室溫下在6 mL DMSO中孵育2 h使其溶解。在氬氣吹掃下，逐份加入甲基亞磺酰陰離子，直到顏色褪色，在室溫下持續(xù)2 h。然后將混合物轉(zhuǎn)移到冰浴中，小心地吸取4 mL甲基化劑CH3I，并將混合物孵育3 h。最后加入水終止反應(yīng)。將混合物透析24 h，并在氬氣流下干燥。然后用甲酸（1 mL）在100℃下水解甲基化產(chǎn)物1 h。除去甲酸后，向樣品中加入2 mL 4 M三氟乙酸（TFA）在安瓿瓶中，用氬氣吹掃，密封，并在100℃下加熱6 h。然后將混合物冷卻，并在氬氣流下干燥。將樣品溶解在0.6 mL蒸餾水中，用硼氫化鈉還原，用（1:1）吡啶 - 乙酸酐在100℃下乙?；? h。將所得的部分甲基化糖醇乙酸酯（PMAA）的等分試樣注入GC - MS系統(tǒng)（Agilent，美國），該系統(tǒng)配備有TR - 35MS柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm，80 - 200℃，15℃/min，然后200 - 260℃，10℃/min）和鐵阱MS檢測器。
2.9. 1H，13C和2D NMR光譜
將聚甘露糖在70℃下攪拌溶解在4 mL D2O中2 h，然后凍干。這個(gè)過程重復(fù)三次。然后將樣品溶解在3 mL D2O中。在Bruker DRX - 500光譜儀上，在25℃的樣品溫度下，分別在500.13和125.77 MHz下記錄高分辨率的1H和13C NMR光譜。使用5 - mm反向幾何1H/13C/15N探頭。使用標(biāo)準(zhǔn)Bruker（Bruker，德國）脈沖序列進(jìn)行同核1H - 1H相關(guān)光譜（COSY，TOCSY）和異核1H - 13C相關(guān)實(shí)驗(yàn)（HMQC，HMBC）。

結(jié)果與討論
3.1. 溫度、時(shí)間和質(zhì)子對聚甘露糖合成的影響
使用d - 甘露糖作為反應(yīng)物，磷酸作為催化劑，通過改進(jìn)的途徑在微波輻射的輔助下合成聚甘露糖。反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和質(zhì)子濃度對聚甘露糖產(chǎn)率的影響如下：
溫度在聚甘露糖的合成速率和產(chǎn)率比中起著關(guān)鍵作用。在本研究中，聚甘露糖合成的最佳溫度為115℃（圖2a），在恒定微波功率輸出900 W、反應(yīng)時(shí)間5 min和質(zhì)子濃度2.5 mol/L的條件下。
反應(yīng)時(shí)間是有效合成的重要因素之一。因此，對聚甘露糖合成進(jìn)行了5 min的時(shí)間進(jìn)程研究（圖2b），溫度為115℃，質(zhì)子濃度為2.5 mol/L。微波輻射5 min后，聚甘露糖的最大產(chǎn)率為91.46％。
磷酸用作催化劑以加速d - 甘露糖的聚合。如圖（圖2c）所示，聚甘露糖的產(chǎn)率隨著質(zhì)子濃度的增加而提高，直到達(dá)到約2.5 mol/L的峰值。其他最佳條件為反應(yīng)溫度115℃和反應(yīng)時(shí)間5 min。
3.2. 聚甘露糖的單糖鑒定和分子量分析
用2 mol/L TFA水解乙醇沉淀的聚甘露糖4.5 h，然后通過HPAEC檢測水解產(chǎn)物。如表1所示，乙醇沉淀的聚甘露糖的組成是d - 甘露糖和微量d - 葡萄糖。
純化的聚甘露糖在HPGPC上洗脫為單一對稱的尖銳峰，分子量分布系數(shù)（Mw/Mn）為1.16，表明純化的聚甘露糖是均勻的。重均分子量（Mw）計(jì)算為2.457 kDa，數(shù)均分子量（Mn）為2.105 kDa，平均聚合度（DP）約為15。
表1 多糖的單糖組成和分子量。