心肌缺血再灌注（I/R）損傷通常發(fā)生在心肌血流受阻后再恢復(fù)缺血心臟的血液供應(yīng)時（Zhou等，2015）。已知心肌I/R損傷會導(dǎo)致循環(huán)驟停、心臟手術(shù)或心肌缺血后出現(xiàn)各種不良心血管后果（Frank等，2012）。根據(jù)先前的研究，心肌I/R損傷是心血管疾病發(fā)展的主要原因，也是與冠狀動脈閉塞相關(guān)的死亡率和發(fā)病率的主要原因（Li等，2016）。盡管已經(jīng)應(yīng)用了多種藥物干預(yù)措施來為心肌I/R損傷主要引起的氧化應(yīng)激提供心臟保護(hù)，但仍需要更有效的治療方法來減少心肌I/R損傷并抑制不可逆細(xì)胞損傷的進(jìn)展（Liu等，2014）。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇3 - 激酶（PI3K）相關(guān)激酶家族的成員，形成兩種不同的復(fù)合物，分別命名為mTORC1和mTORC2（Okamoto等，2016）。核因子 - κB（NF - κB）是一種普遍存在且重要的轉(zhuǎn)錄因子，具有多種刺激物，包括生長因子和細(xì)胞因子，可控制與免疫反應(yīng)相關(guān)的多種基因的表達(dá)（Miller等，2014；Zhu等，2014）。Ahmad等還表明，NF - κB途徑可以作為與各種下游和上游信號通路相互作用的關(guān)鍵中心途徑，包括mTOR途徑（Ahmad等，2013）。根據(jù)相關(guān)研究，NF - κB誘導(dǎo)與生存、生長、分化甚至神經(jīng)細(xì)胞激活相關(guān)的基因的激活，如促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl - 2（Mattson，2005）。此外，自噬樣細(xì)胞的死亡導(dǎo)致心肌缺血引起的腦損傷，其過程主要由mTOR/NF - κB調(diào)節(jié)（Chen等，2013；Li等，2013）。在各種實驗中，高位胸段硬膜外麻醉（HTEA）已顯示出對腸道功能、區(qū)域血流以及微血管灌注的保護(hù)作用，近年來HTEA已廣泛應(yīng)用于主要的心臟手術(shù)中（Enigk等，2014；Wang等，2016）。此外，HTEA已被報道可改善缺血性心臟病患者的心肌功能（Jakobsen等，2009）。綜上所述，mTOR/NF - κB信號通路和HTEA均影響心肌I/R損傷。

因此，本研究旨在探討mTOR/NF - κB信號通路在HTEA對抗大鼠心肌I/R損傷中的作用。

本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、廣西心腦血管疾病精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點實驗室培育基地的實驗動物使用和保護(hù)倫理委員會批準(zhǔn)。

共90只健康成年雄性Sprague - Dawlay（SD）大鼠（270 ~ 330 g），由河北省實驗動物中心提供（許可證號：SCXK（河北）2013 - 1 - 003）。所有大鼠均以正常飼料飼養(yǎng)，在室溫（21℃ ~ 23℃）、恒定濕度（53% ~ 55%）下自由飲水和進(jìn)食。每天按時供應(yīng)充足的水，更換塑料，避免噪音和其他干擾。

將90只大鼠分為六組（每組15只）：正常組（正常健康大鼠）；假手術(shù)組，對大鼠進(jìn)行左胸切開術(shù)，但不結(jié)扎左冠狀動脈；I/R組，構(gòu)建心肌I/R損傷大鼠模型；HTEA組，對I/R大鼠進(jìn)行麻醉后分離皮下組織，分離韌帶形成穿刺，將硬膜外導(dǎo)管的一端插入硬膜外腔，另一端用皮膚縫線固定在背部（如果導(dǎo)管的前端位于第3 ~ 4肋間間隙，則模型成功建立）；PDTC（吡咯烷二硫代氨基甲酸酯）組，在建立心肌I/R損傷模型前15分鐘，腹腔注射PDTC（15 mg/kg；深圳晶美生物工程有限公司，深圳，中國），一種核因子κB（NF - κB）抑制劑；HTEA + PDTC組，在建立心肌I/R損傷模型前15分鐘，腹腔注射PDTC（15 mg/kg；深圳晶美生物工程有限公司，深圳，中國），并在模型成功建立后進(jìn)行HTEA，與HTEA組相同。

建立大鼠心肌I/R損傷模型。模型組60只大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（15 mg/kg；上海泰瑞爾生物技術(shù)有限公司，上海，中國）麻醉15分鐘。打開大鼠氣管，插入導(dǎo)管連接動物呼吸機(jī)（ALC - V9；上海奧爾科特生物科技有限公司，上海，中國）進(jìn)行正常呼吸，氧氣濃度為33%。調(diào)整和維持呼吸頻率和潮氣量，使pH值在7.35 ~ 7.45之間，PaCO?在25 ~ 40 mmHg之間，PaO?在90 ~ 150 mmHg之間（1 mmHg = 0.133 kPa）。使用智能恒溫控制器（成都泰盟科技有限公司，成都，中國）維持大鼠體溫在36℃至37℃之間。在第五肋間進(jìn)行左胸切口，打開心包，在左心耳下緣結(jié)扎左冠狀動脈前降支（LAD）30分鐘，在縫合線末端設(shè)置自制橡膠套。心電圖顯示ST段弓背抬高，結(jié)扎線下心肌變暗，左心室發(fā)紺，表明心肌缺血。松開結(jié)扎線后再灌注120分鐘，心外膜充血表明再灌注成功，表明心肌I/R損傷大鼠模型成功建立。假手術(shù)組15只大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg；上海泰瑞爾生物技術(shù)有限公司，上海，中國）麻醉15分鐘，然后進(jìn)行左胸切口，但不結(jié)扎左冠狀動脈。正常組15只大鼠注射等體積生理鹽水。

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（15 mg/kg，上海泰瑞爾生物技術(shù)有限公司，上海，中國）麻醉15分鐘。采集六組大鼠的心臟靜脈血（15 mL），收集到真空采血管中。分離血液樣本的血清和血漿，并分別保存用于進(jìn)一步實驗。按照試劑盒的操作指南，采用雙抗體夾心親和素 - 生物素過氧化物酶復(fù)合物 - ELISA（ABC - ELISA）。使用ELISA試劑盒（森雄生物技術(shù)有限公司，上海，中國）檢測肌酸激酶同工酶（CK - MB）、肌鈣蛋白I（TnI）、肌鈣蛋白T（TnT）、肌紅蛋白（MYO）和N末端腦鈉肽前體（NT - proBNP）的表達(dá)。

大鼠采血后10分鐘處死，分離心臟。收集每組大鼠的左心室心肌組織并保存。將少量左心室心肌切成小塊，脫蠟，然后進(jìn)行梯度乙醇水化。水化后的組織切片浸入蘇木精中5 ~ 20分鐘進(jìn)行細(xì)胞核染色。用流水沖洗3 ~ 5分鐘后，用1%鹽酸 - 乙醇溶液分化5 ~ 30秒。再用流水沖洗3分鐘后，加入弱堿性水溶液30秒至1分鐘進(jìn)行返藍(lán)。然后用流水沖洗5 ~ 10分鐘，隨后將水化切片浸入伊紅溶液中染色細(xì)胞質(zhì)。進(jìn)行梯度乙醇脫水。最后，在封片后使用CX21光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯光學(xué)有限公司，東京，日本）觀察組織樣本。

取大鼠心肌組織，從心尖到心底切成1 ~ 2 mm厚的切片，加入1% TTC溶液。將組織切片在37℃恒溫水浴中浸泡20分鐘，然后在10%甲醛中固定過夜。在顯微鏡下觀察，梗死區(qū)呈灰色，而無梗死區(qū)呈紅色。在解剖顯微鏡下分離梗死心肌組織和非梗死心肌組織，并計算其質(zhì)量。心肌梗死的大小表示為心肌梗死質(zhì)量占心肌質(zhì)量的百分比（Kiss等，2016）。

左心室心肌組織用4%多聚甲醛（北京雷根生物技術(shù)有限公司，北京，中國）固定24小時，然后進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋。將石蠟包埋的組織切成3 ~ 5μm厚的連續(xù)切片，脫蠟、水化，然后進(jìn)行高壓蒸煮進(jìn)行抗原修復(fù)。組織切片用20μg/mL蛋白酶K在37℃下消化30分鐘。加入H?O?在室溫下孵育10分鐘以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。切片用含有0.1% Triton X - 100的0.1%檸檬酸鈉溶液滲透。在冰浴2分鐘后，切片在37℃下與新鮮的反應(yīng)溶液孵育1小時。

加入過氧化物酶標(biāo)記的熒光素抗體在37℃下孵育30分鐘，然后加入新鮮的二氨基聯(lián)苯胺（DAB）在室溫下顯色。用蘇木精對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染30秒。切片用0.5%鹽酸 - 乙醇溶液分化并沖洗變藍(lán)。用梯度乙醇脫水，用二甲苯透明，并用中性樹膠封片。正常細(xì)胞核染成藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核染成深棕色。在光顯微鏡下（400×）隨機(jī)選擇每個切片的五個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞的數(shù)量。凋亡指數(shù)（AI）指凋亡程度。AI = 凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%（Hu等，2016）。

使用RNA提取試劑盒（天根生物技術(shù)有限公司，北京，中國）從每組大鼠的心肌組織中提取總RNA。設(shè)計并合成了mTOR、NF - κB、核因子 - κB亞基（p50）、核因子 - κB亞基（p65）、fas配體（Fasl）、Bcl - 2相關(guān)X蛋白（Bax）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病 - 2（Bcl - 2）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）、BCL2/腺病毒E1B 19 kDa蛋白相互作用蛋白 - 3（BNIP3）、自噬相關(guān)基因5（Atg5）和甘油醛 - 3 - 磷酸脫氫酶（GAPDH）的引物序列（Takara生物技術(shù)有限公司，大連，中國）。根據(jù)Prime Script RT試劑盒（Takara生物技術(shù)有限公司，大連，中國）的說明，將轉(zhuǎn)錄（10μL）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄在37℃下反應(yīng)45分鐘，逆轉(zhuǎn)錄酶失活在85℃下反應(yīng)5秒。使用SYBR® Premix Ex TaqTM II試劑盒（Takara生物技術(shù)有限公司，大連，中國）進(jìn)行RT - qPCR。反應(yīng)體系（共50μL）包括25μL的2×SYBR® Premix Ex TaqTM II（Takara生物技術(shù)有限公司，大連，中國）、2μL的PCR正向引物、2μL的PCR反向引物、1μL的50×ROX參考染料（Invitrogen公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州，美國）、4μL的DNA模板和16μL的ddH?O。使用ABI P.RISM® 7300系統(tǒng)（ABI公司，牡蠣灣，紐約）進(jìn)行RT - qPCR。

反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火和延伸30秒，共40個循環(huán)。引物用二乙基焦碳酸酯（DEPC）水溶解至濃度為100μM，然后稀釋至10μM，分裝并儲存在 - 20℃下。GAPDH作為內(nèi)參。使用2 - ??Ct方法計算組織中mTOR、p50、p65、Fasl、Bcl - 2、Bax、LC3、BNIP3和Atg5 mRNA的相對表達(dá)量（Wang等，2013）。

將每組大鼠的左心室心尖組織切成片，置于勻漿器底部。向樣品中加入Western細(xì)胞裂解緩沖液（批號：P0013C；Beyotime生物技術(shù)有限公司，上海，中國）、苯甲基磺酰氟（PMSF，一種絲氨酸蛋白酶抑制劑）（上海春試生物技術(shù)有限公司，上海，中國）和酚磺基轉(zhuǎn)移酶（PST，一種磷酸酶抑制劑）（Abcam貿(mào)易有限公司，上海，中國），然后使用超聲細(xì)胞破碎儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司，北京，中國）破碎三次，在低溫下保持30分鐘。細(xì)胞裂解后，將組織勻漿轉(zhuǎn)移到1.5 mL Eppendorf（EP）管中。將組織勻漿（1500 g）在4℃下用離心機(jī)離心30分鐘。收集上清液并分裝到離心管中并低溫保存。使用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（批號：P0012；Beyotime生物技術(shù)有限公司，上海，中國）檢測組織中蛋白質(zhì)的濃度。用細(xì)胞裂解液將蛋白質(zhì)樣品調(diào)整至相同的蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品與緩沖溶液混合并在95℃下煮沸5分鐘以完全變性蛋白質(zhì)，然后在低溫冰箱中冷凍保存。使用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離每個樣品的蛋白質(zhì)（20mg），并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封閉蛋白質(zhì)2小時。加入一抗后，將蛋白質(zhì)樣品在4℃下孵育過夜：NF - κB（1:1000；#8242）、mTOR（1:1000；#5536）、p50（1:1000；#13586）、p65（1:1000；#8242）、Bax（1:1000；#14796）、Bcl - 2（1:1000；#3498）、LC3 - I（1:1000；#4599）、LC3 - II（1:1000；#3868）、BNIP3（1:1000；#12396）、Atg5（1:1000；#12994）（均來自Cell Signaling Technologies，貝弗利，馬薩諸塞州，美國）、FasL（1:1000；ab15285；Abcam公司，劍橋，馬薩諸塞州，美國）和GAPDH（1:1000；#5174；Cell Signaling Technologies，貝弗利，馬薩諸塞州，美國）。樣品用Tris緩沖鹽水吐溫 - 20（TBST）沖洗三次。加入二抗后，樣品孵育2小時。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（中科生物試劑有限公司，上海，中國）顯影。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜加入化學(xué)發(fā)光試劑A和B溶液（中科生物試劑有限公司，上海，中國）并在暗室中保存。

曝光后，使用自動處理器對樣品進(jìn)行顯影和固定。GAPDH作為內(nèi)參，使用BandScan 5.0軟件（Glyko公司，深圳，中國）分析蛋白質(zhì)條帶。蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量顯示為目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的灰度值比。