摘要：
本研究應(yīng)用超聲（400 W，U）、微波加熱（75℃，15分鐘，M）和超聲與微波協(xié)同加熱（UM）對乳清分離蛋白（WPI）進(jìn)行預(yù)處理，以探究并比較它們對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase）誘導(dǎo)的WPI的結(jié)構(gòu)、理化及功能特性的影響。尺寸排阻色譜結(jié)果表明，所有三種物理預(yù)處理均能促進(jìn)TGase交聯(lián)的WPI中聚合物的形成，聚合物的數(shù)量按U、UM和M預(yù)處理的順序增加。在這三種物理方法中，M預(yù)處理對TGase誘導(dǎo)的WPI的結(jié)構(gòu)和功能特性影響最強(qiáng)。此外，與TGase誘導(dǎo)的WPI相比，M處理的TGase誘導(dǎo)的WPI（M - WPI - TGase）的α - 螺旋和β - 轉(zhuǎn)角分別減少了7.86%和2.93%，而其β - 折疊和不規(guī)則卷曲分別增加了15.37%和7.23%。M - WPI - TGase的Zeta電位、乳液穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性分別增加了7.8%、59.27%和28.95%。本實(shí)驗(yàn)表明，對于WPI，M是比U和UM更有效的預(yù)處理方法，能夠促進(jìn)其與TGase的反應(yīng)并改善其功能特性。

1. 引言
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase，EC 2.3.2.13）通?？赏ㄟ^微生物發(fā)酵獲得，它能催化蛋白質(zhì)中谷氨酰胺（作為?；w）殘基和賴氨酸（作為酰基受體）殘基之間的催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)、脫酰胺反應(yīng)和交聯(lián)聚合。TGase修飾的食品蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能已被廣泛研究，如大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白等。然而，天然的α - 乳白蛋白和β - 乳球蛋白是緊密的球狀蛋白，這阻礙了它們的TGase反應(yīng)位點(diǎn)暴露，導(dǎo)致TGase與WPI的反應(yīng)降低。因此，有必要改變?nèi)榍宓鞍椎慕Y(jié)構(gòu)，以便使其與TGase更容易交聯(lián)。
超聲（U）已被證實(shí)是一種能改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性的新技術(shù)，此外，它是一種不含有外源化學(xué)添加劑的環(huán)境友好型技術(shù)。例如，Cheng等人發(fā)現(xiàn)，在20/28 kHz下處理10分鐘的乳清蛋白乳液凝膠的凝膠特性顯著增強(qiáng)。大豆分離蛋白（SPI）在400 W超聲處理40分鐘后與TGase交聯(lián)，可增強(qiáng)SPI的凝膠特性并提高核黃素的包埋率，還能顯著降低核黃素在后續(xù)消化過程中的釋放率。Nazari等人證明，經(jīng)過20 kHz超聲處理5、12.5和20分鐘后，小米濃縮蛋白的溶解性、乳化特性、發(fā)泡能力和發(fā)泡穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。有報(bào)道稱，超聲（40 kHz，300 W）可用于促進(jìn)TGase誘導(dǎo)的SPI和小麥面筋混合物的凝膠特性。超聲對液體系統(tǒng)的影響可能與聲空化現(xiàn)象有關(guān)，在超聲過程中，空化氣泡迅速形成并劇烈崩潰。在蛋白質(zhì)溶液中，更多反應(yīng)位點(diǎn)的暴露通過空化效應(yīng)和超聲預(yù)處理的剪切應(yīng)力導(dǎo)致交聯(lián)反應(yīng)增加。眾所周知，蛋白質(zhì)在超聲預(yù)處理后會產(chǎn)生大量自由基，此外，據(jù)報(bào)道，自由基可引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾和氧化降解。
微波（M）是頻率范圍在0.3 - 300 GHz的電磁波。微波加熱（2450 MHz）是一種介電處理方法，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。M誘導(dǎo)修飾的潛在機(jī)制主要考慮溫度的快速升高和電磁效應(yīng)。微波場中的電磁效應(yīng)可以重新排列電場分布，破壞電殘基之間的靜電相互作用，從而有助于蛋白質(zhì)的解離和穩(wěn)定。此外，據(jù)報(bào)道，活性自由基的形成也是微波誘導(dǎo)修飾的原因之一。有報(bào)道稱，M可以改變蝦蛋白的二級結(jié)構(gòu)，增加β - 折疊，減少β - 轉(zhuǎn)角。在微波加熱（30℃）下形成的TGase誘導(dǎo)的乳蛋白的聚合速率是在相同溫度下通過常規(guī)加熱的三倍。此外，Qin等人發(fā)現(xiàn)，隨著微波功率（0 - 700 W）的增加，M處理顯著提高了大豆蛋白和小麥蛋白經(jīng)TGase誘導(dǎo)后的凝膠強(qiáng)度、持水力和儲能模量。上述眾多研究表明，單一的微波加熱或超聲可以促進(jìn)TGase與食品蛋白質(zhì)的反應(yīng)。盡管超聲和微波的機(jī)制完全不同，但學(xué)者們先前已經(jīng)證明，微波和超聲（UM）預(yù)處理之間的協(xié)同作用在生物材料的開發(fā)和天然產(chǎn)物的提取中起著至關(guān)重要的作用。此外，據(jù)報(bào)道，微波輻射可以迅速滲透到復(fù)雜結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，這是空化無法實(shí)現(xiàn)的，微波效應(yīng)有助于加速超聲處理的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。因此，UM預(yù)處理可能是比單獨(dú)的M和U預(yù)處理更好的修飾方法。然而，超聲和微波的協(xié)同處理是否會促進(jìn)WPI與TGase的交聯(lián)反應(yīng)，或增強(qiáng)WPI的功能特性仍不清楚。因此，本研究的目的是比較三種物理預(yù)處理（微波輔助超聲（UM）、單獨(dú)微波和超聲）對TGase誘導(dǎo)的WPI的結(jié)構(gòu)和功能特性的影響。這些發(fā)現(xiàn)將為有效的蛋白質(zhì)修飾方法和制備具有更好功能特性的乳清蛋白提供技術(shù)數(shù)據(jù)支持。此外，為食品工業(yè)提供了一種具有優(yōu)異功能特性的新型食品成分。

2. 材料和方法
2.1. 材料
WPI（蛋白質(zhì)含量93.5%）購自Mullins Whey Inc.（美國威斯康星州莫斯內(nèi)）。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（酶活性1000 U/g蛋白）購自一鳴生物制品有限公司。D - 檸檬烯購自MAYA公司。十二烷基硫酸鈉（SDS）、三氟乙酸（TFA）、三羥甲基氨基甲烷（tris）購自Sigma - Aldrich（美國密蘇里州圣路易斯）。鄰苯二甲醛購自Biotopped Technology Co.，Ltd（中國北京）。三氯乙酸購自天津廣福精細(xì)化工研究所。溴化鉀（KBr）購自Macklin Biochemical Co.，Ltd（中國上海）。本研究中使用的所有化學(xué)試劑均為分析純。
2.2. 三種物理方法制備的WPI的制備
將WPI溶解在蒸餾水中，在室溫下磁力攪拌2小時(shí)，配置成濃度為50 mg/mL的WPI溶液。隨后，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)WPI懸浮液的pH至7。
2.2.1. 超聲處理的WPI的制備
使用XH - 300PE超聲微波組合合成器對WPI懸浮液進(jìn)行超聲處理。超聲處理（25 kHz）在400 W下進(jìn)行15分鐘。為了在超聲過程中保持約22 ± 3℃，將WPI樣品浸入冰浴中，并將程序設(shè)置為工作2分鐘，然后停止1分鐘。超聲處理后的WPI樣品標(biāo)記為U - WPI。
2.2.2. 微波處理的WPI的制備
使用XH - 300PE超聲微波組合合成器在75℃下對WPI溶液進(jìn)行單獨(dú)微波加熱15分鐘。微波加熱后的樣品隨后冷卻至室溫并標(biāo)記為M - WPI。
2.2.3. 超聲和微波處理的WPI的制備
將超聲功率設(shè)置為400 W，頻率設(shè)置為25 kHz，微波加熱溫度設(shè)置為75℃，同時(shí)將WPI溶液加載到三頸燒瓶中，并在超聲和微波共同作用下于75℃加熱15分鐘。在此期間，超聲與微波協(xié)同的程序設(shè)置為工作2分鐘 - 暫停2分鐘，以保持反應(yīng)溫度在75℃。上述處理后的WPI樣品冷卻至室溫后標(biāo)記為UM - WPI。
2.2.4. 物理預(yù)處理前暴露的TGase誘導(dǎo)的WPI的制備
將30 U/g TGase添加到經(jīng)不同物理預(yù)處理（U - WPI、M - WPI、UM - WPI）修飾的WPI溶液中，并將所得WPI置于50℃水浴中4小時(shí)，以確保WPI與TGase充分反應(yīng)。4小時(shí)后，將它們置于75℃水浴中15分鐘以使TGase失活。隨后，將樣品在冰水浴中冷卻至室溫并冷凍干燥。上述WPI樣品記錄為U - WPI - TGase、M - WPI - TGase和UM - WPI - TGase。對照組為TGase誘導(dǎo)的WPI（WPI - TGase）和經(jīng)三種不同物理預(yù)處理的WPI。